Mécanisme catalytique des enzymes élargi

Les enzymes sont des catalyseurs exceptionnellement puissants qui reconnaissent les substrats moléculaires et les traitent dans des sites actifs. Ils sont généralement construits à partir de seulement 20 types d’acides aminés et leur mécanisme catalytique est généralement assemblé à partir de groupes chimiques dans les chaînes latérales d’acides aminés, souvent avec des ions métalliques ou des cofacteurs très liés. Cela soulève la question de savoir si le répertoire catalytique des enzymes pourrait être élargi en utilisant un «alphabet» étendu d’acides aminés offrant une gamme plus étendue de chaînes latérales pour la catalyse. Écrire dans La nature, rapportez la construction d’une enzyme qui utilise un groupe chimique catalytique non naturel et montrez que ses propriétés catalytiques peuvent être grandement améliorées à l’aide d’une approche appelée évolution dirigée.

Les chaînes latérales des acides aminés présentes dans les enzymes contiennent au plus un groupe chimique et sont essentielles pour la reconnaissance moléculaire. Mais moins de la moitié de ces chaînes latérales contiennent des groupes qui peuvent agir en tant qu’acides, bases ou nucléophiles (donneurs à paires d’électrons) dans les cycles catalytiques enzymatiques. Aucune des chaînes latérales ne peut agir en tant qu'électrophile (accepteurs de paires d'électrons), ce qui pourrait également être utile pour la catalyse. L’introduction de résidus d’acides aminés non naturels portant des chaînes latérales potentiellement catalytiques pourrait donc ouvrir la voie à un large éventail de nouvelles réactions enzymatiques.

Les catalyseurs conventionnels sont une source d'inspiration fertile pour les groupes chimiques susceptibles d'élargir le répertoire catalytique des enzymes: les catalyseurs organiques à petites molécules (organocatalyseurs) et les catalyseurs à base de métaux de transition peuvent activer les molécules de substrat de manière à permettre diverses réactions utiles synthèse organique. Pour permettre aux enzymes d'accéder à cette réactivité excitante, des méthodes sont nécessaires pour l'incorporation efficace d'acides aminés spécifiques à un site et portant de nouveaux groupes chimiques. Des méthodes pour l'évolution dirigée des enzymes modifiées résultantes sont également nécessaires pour optimiser la catalyse dans les sites actifs.

Des enzymes artificielles ont déjà été construites en liant des catalyseurs à base de métaux de transition à une petite molécule appelée biotine, qui se lie à son tour de manière non covalente avec une affinité extrêmement élevée à la protéine streptavidine, ce qui ancre ainsi le catalyseur dans un cadre protéique.^,. Des catalyseurs métalliques ont également été liés de manière covalente aux chaînes latérales de résidus d'aminoacides non naturels qui ont été incorporés dans des protéines à l'aide d'un mécanisme de synthèse de protéines biologique modifié.. Avec ces deux stratégies, l'évolution dirigée a été utilisée pour améliorer considérablement l'efficacité catalytique et le chiffre d'affaires (le nombre moyen de réactions catalysées par chaque enzyme) des enzymes artificielles initialement produites et, dans certains cas, pour augmenter la sélectivité de l'enzyme pour un isomère d'image miroir particulier du produit (énantiosélectivité). Des enzymes artificielles ont ainsi été produites qui catalysent des réactions inconnues de la nature, notamment des réactions de formation de liaisons silicium-carbone.et des réactions de formation de liaison carbone – carbone connues sous le nom de cyclopropanations et réactions de métathèse de fermeture de cycle.

Burke et al. a pris une approche différente. Ils ont commencé à partir d'une enzyme (BH32) qui avait été conçu pour catalyser un type particulier de réaction de formation de liaison carbone-carbone, mais qui catalyse également faiblement une transformation indépendante: l'hydrolyse de composés appelés esters de 2-phénylacétate (figure 1). Les auteurs ont donc décidé de remodeler l'enzyme pour en faire un catalyseur efficace de ces hydrolyses.

Les chercheurs ont déterminé qu'un résidu d'acide aminé histidine (His23) dans BH32 forme un intermédiaire appelé composé acyl – enzyme au cours du cycle catalytique. Cet intermédiaire est ensuite hydrolysé pour donner le produit de la réaction enzymatique. Cependant, le taux de renouvellement catalytique était faible car l'hydrolyse de l'intermédiaire acyle – enzyme était lente.

Pour résoudre ce problème, Burke et ses collègues ont remplacé His23 par un acide aminé non naturel génétiquement codable appelé N_™-méthylhistidine (Me-His; figure 1). Me-His est un analogue de l'histidine dans lequel un groupe méthyle est attaché à l'un des atomes d'azote de la chaîne latérale. Les auteurs ont observé que le taux de renouvellement catalytique de l'enzyme modifiée (OE1) était supérieur à celui de BH32, ce qu'ils attribuaient à une hydrolyse plus rapide de l'intermédiaire acyle – enzyme.

Burke et al. ensuite utilisé une évolution dirigée pour optimiser la fonction de Me-His dans le site actif de l’enzyme. Un large éventail de stratégies a été utilisé pour introduire des mutations, aboutissant finalement à la découverte d'une variante, OE1.3, qui avait amélioré l'efficacité catalytique. Ce variant se différenciait de OE1 par six mutations, dans lesquelles un résidu d'acide aminé avait été remplacé par un autre. Les auteurs ont découvert que OE1.3 hydrolyse une gamme d'analogues d'esters de 2-phénylacétate dans lesquels seuls des atomes d'hydrogène sont liés à l'atome de carbone adjacent au groupe carbonyle (C = O) dans les molécules. Cependant, les analogues dans lesquels un groupe méthyle est attaché à côté du groupe carbonyle étaient des substrats pauvres. Les auteurs ont donc poursuivi leur évolution dirigée pour générer OE1.4, une enzyme qui présente une activité catalytique améliorée avec cette classe de substrat et qui hydrolyse de manière prédominante l’un des deux isomères en miroir de chaque substrat.

Le résidu Me-His dans les enzymes modifiées joue le rôle de catalyseur nucléophile qui est globalement analogue aux résidus nucléophiles présents dans les enzymes sérine hydrolase et cystéine hydrolase. Mais comment l’organocatalyse pourrait-elle en général inspirer la découverte d'enzymes plus éloignées de celles que l'on trouve dans la nature? Les organocatalyseurs accélèrent de nombreuses réactions différentes en utilisant seulement quelques mécanismes génériques (modes d'activation), mais la catalyse est souvent inefficace, nécessitant des charges de catalyseur assez élevées (généralement de 5 à 20% en moles). Certains de ces modes d'activation sont également largement utilisés par les enzymes; par exemple, la catalyse enamine est utilisée par les aldolases de classe I. Mais d'autres modes d'activation sont moins largement utilisés par voie enzymatique, bien qu'ils puissent permettre de nombreuses réactions synthétiques potentiellement utiles.

Les organocatalyseurs ont été introduits dans les protéines de diverses manières, par exemple en utilisant un groupe biotine attaché comme ancre qui se lie à la streptavidineou par modification chimique de résidus d'acides aminés non naturels codés génétiquement. Toutefois, pour tirer pleinement parti d'une gamme élargie de groupes chimiques catalytiques, il est probable qu'une optimisation substantielle sera nécessaire pour générer des sites actifs catalytiquement efficaces. Burke et al. ont montré que l'évolution dirigée peut améliorer les enzymes contenant un groupe organocatalytique non naturel. Leur approche pourrait également fournir une voie vers des enzymes efficaces utilisant des modes d’activation non trouvés dans la nature et beaucoup plus efficaces que les organocatalyseurs eux-mêmes.